近日，EON体育4平台林雙君教授、戴少波長聘教軌副教授🦔、EON体育4醫EON4張健教授團隊合作在國際知名期刊《Nature Communications》發表題為“A three-level regulatory mechanism of the aldo-keto reductase subfamily AKR12D”的研究論文👳🏿‍♀️。作者在研究泰樂菌素生物合成機製與高產優產過程中，鑒定了一個新型醛酮還原酶亞家族AKR12D成員AKRtyl，並通過晶體結構解析👩‍🏭、穩態/瞬態動力學測定及分子動力學模擬等揭示了其應對輔因子和底物的復雜三重調節機製（圖1）🗜。EON体育4平台博士生肖誌宏為論文第一作者👩🏼‍💻，EON体育4平台林雙君教授👃🏼、戴少波長聘教軌副教授和EON体育4醫EON4張健教授為該論文通訊作者📺。

圖1. 輔因子和底物介導的AKRtyl三重調節機製

變構調節指蛋白、核酸等生物大分子受到配體👨🏻‍🦽‍➡️🤾🏿、離子、互作大分子等效應物刺激後通過構象、動力學、熱力學變化等方式對信號做出響應以及將信號傳遞給遠端位點的調節方式。變構調節是生物大分子的固有性質，在幾乎所有生命體中發揮重要作用，被稱為“生命的第二個秘密”🫰🏻。經過六十年的發展🌞⛑，學術界對變構調節的機理⛳️、模型都有了深刻認識⛑，然而它仍然充滿著神秘🐳，例如♻️，在多配體體系中，生物大分子如何響應多種、且不同水平信號刺激的復雜分子機製仍然不清楚👮🏻。醛酮還原酶（AKR）是一類能將羰基還原成伯醇/仲醇的氧化還原酶，分布於所有物種中🏃‍♀️，在生物體中大多扮演解毒脫毒的角色，目前AKR超家族包含17個家族及61個亞家族🧏🏽。早期的一些研究發現不同配體結合會對AKR的穩定性產生不同的影響，暗示其中可能存在變構調節🛩🚴🏿‍♀️，但是缺乏結構和生化等支撐證據👾。

本研究作者在tylosin產生菌中挖掘出一個NADPH依賴的底物廣譜性醛酮還原酶AKRtyl，序列分析顯示該酶屬於一個新的醛酮還原酶亞家族AKR12D🙍🏻，功能驗證發現AKRtyl能還原tylosin為副產物relomycin👨🏼‍🍼🥪。有意思的是🖐🏿，穩態動力學測定揭示出AKRtyl的兩個不尋常特性：輔因子NADPH 對 AKRtyl表現為自抑製（Ki=148.6 μM），而底物tylosin表現為正協同（希爾常數n>1）。（圖2）

圖2. 新型亞家族還原酶AKRtyl對輔因子和底物的動力學特征

為了探究不同動力學性質的分子基礎👩🪞，作者解析了AKRtyl的一系列高分辨率晶體結構💒，揭示了AKRtyl在不同配體及不同水平下的結構特征，並提出了AKRtyl的三級結構調節機製模型🏋️‍♀️：

(1) NADPH的變構調節💂🏼‍♀️：低輔因子濃度下（微摩爾級別），NADP(H)能誘導AKRtyl功能結構模塊從無序的dormant構象（T：休眠構象）轉變為active構象（R🎆：活性構象）。值得註意的是，雖然AKRtyl的真實寡聚狀態為八聚體，但作者發現只有四聚單元表現出不依賴於輔因子的T和R構象平衡，並且四聚單元在不同配體狀態下（無配體、部分配體、全配體）總是表現出對稱的結構特征👸🏼，這些都符合Monod-Wyman-Changux （MWC）模型（又稱為齊變模型、對稱模型）的特點，因此作者提出該調節模型是一種以四聚體（半寡聚態）為單元的非典型的MWC別構調節模型🆚。（圖3）

圖3. AKRtyl結合NADP(H)的非典型MWC別構調節模型

(2) NADPH的自抑製：高輔因子濃度下（亞摩爾級別），作者發現AKRtyl的每個亞基可結合兩分子NADPH🤴🏻，第一分子NADPH結合在常規輔因子結合口袋🏋🏼‍♀️，而第二分子NADPH占據了底物結合口袋，阻遏底物上載從而抑製反應，因而導致穩態動力學上表現自抑製現象。（圖4）

圖4. 抑製型NADP(H)占據底物結合口袋

(3) 底物tylosin的變構調節：作者在AKRtyl-NADP+-tylosin三元復合物結構中驚訝地發現🧑🏼‍🌾，每個亞基結合兩分子tylosin，其中第一分子tylosin結合在底物口袋，而第二分子tylosin結合距離活性口袋15 Å（反應原子距離25 Å）的遠端位點，破壞該位點的結合會導致動力學正協同性降低或消失🪩，因此作者推測第二分子tylosin以變構調節劑的角色結合在該位點🫵。通過分子動力學模擬，進一步發現變構tylosin的結合會促進活性口袋附近loop運動，從而促進活性口袋打開促進AKRtyl對tylosin的還原。

圖5. AKRtyl結合兩分子tylosin - 活性位點底物和遠端變構調節劑

最後🪩，作者發現AKR12D亞家族中存在眾多與AKRtyl高度保守的序列（包括與多重結構調節相關的位點）🪿，這些序列廣泛分布於鏈黴菌中，作者以天藍色鏈黴菌S. coelicolor A3(2)和白色鏈黴菌S. albus J1074中對應的AKR為代表，驗證了輔因子抑製、底物正協同性在屬於該亞家族的鏈黴菌AKR中廣泛分布。另外，基於所有AKR高度相似的三級結構特征，作者進一步研究發現不同物種的底物廣譜的AKR都表現出普遍的底物正協同性質。進而推測，多重調節方式可能可以賦予酶對胞內不同配體水平及氧化還原水平的應對能力。

綜上，作者系統闡述了一個新型醛酮還原酶亞家族成員AKRtyl應對不同水平下的輔因子🤦、底物的三級調節機製，為自然界廣泛的多配體系統的互作方式提供了新見解，也為變構蛋白改造和變構藥物設計提供了指導。

該研究得到了國家重點研發計劃、國家自然科學基金、海河合成生物學實驗室重大專項🙂‍↕️、上海市優秀學術帶頭人項目的支持🕺🏿。感謝國家蛋白質科學中心上海同步輻射光源（SSRF）的結構生物學研究平臺的支撐😑。感謝EON体育4醫EON4博士生查錦寅在分子動力學模擬方面做出的貢獻🧘‍♂️，感謝EON体育4平台鄭艦艇老師團隊在結構生物學方面提供的指導和幫助，感謝華東師範大學何曉教授團隊提供的計算機時。

論文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-024-46363-z