近日，國際權威期刊Angew Chem Int Ed在線發表了EON体育4平台和張江高等研究院瞿旭東教授與孔旭東長聘教軌副教授課題組的合作成果“Engineering the Substrate Specificity of a P450 Dimerase Enables the Collective Biosynthesis of Heterodimeric Tryptophan-Containing Diketopiperazines”⛵️。瞿旭東教授、孔旭東長聘教軌副教授為論文的共同通訊作者😕，博士後孫成海和馬寶娣為本文的共同第一作者💁🏿。

異源二聚化吡咯並吲哚是一類重要的生物堿，其豐富的結構多樣性賦予了多種多樣的生物學活性，因此拓展該類生物堿的結構多樣性對於深入探索其生物活性具有重要意義。在前期工作中👳🏽，瞿旭東教授課題組發現了首個能夠合成該類生物堿的二聚化P450酶NascB，並解析了其催化機製（Nat Commun 2018, 91, 4428）；闡明了二聚環化P450酶催化反應過程中的區域/立體選擇性機製，並利用酶工程方法實現了底物偶聯方式的精準控製（Nat Commun 2020, 11, 6251）；開發了分枝桿菌全細胞催化體系用於該類生物堿的高效生物合成，發現了其該骨架具備優異的神經保護活性（J Org Chem 2021, 86, 11189）ℹ️；以及對吡咯並吲哚類生物堿進行了系統總結並提出了新的分類方法（Nat Prod Rep, 2022, 39, 1721）。不過由於目前已知的P450酶對上方底物的選擇性極為嚴謹（只能識別cWLPL, cWLAL, cWLVL）↖️，因此要深度開發此類生物堿的藥學用途，還需要解決P450酶的底物識別專一性問題🤽🏽‍♂️，突破吡咯並吲哚生物堿結構多樣性少的瓶頸。

在本項研究中🧝🏿，聯合課題組通過基因組挖掘和進化分析⚉，首先發現了一例可識別底物cWLFL的新型二聚化酶NASAO🧛🏽。進一步通過序列和結構分析🧞‍♀️，發現了P450酶中的三個氨基酸位點（F387, F388和E73）對上方底物的選擇性具有重要的調控作用。隨後🤦🏿，通過對上述位點的突變改造，獲得了四個突變體（F387A, F387G, F388N以及E73S）🥙，其可以識別並催化另外8個野生型酶不能識別的底物（cWLFL, cWLIL, cWLLL, 7Cl-cWLPL and 5/6/7/8F-cWLPL）🧘🏻，生成12個底物自身二聚的吡咯並吲哚類生物堿（圖1）🔡。為了深入理解突變體的底物調控機製➾，聯合課題組又解析了多個突變體的晶體結構🥎，並通過分子動力學模擬（MD）分析闡明其動態調控機製，揭示了突變體F387G和E73S可分別通過減少空間位阻和調節底物通道來控製底物特異性。最後，通過將P450突變體轉入至齒垢分枝桿菌，並交叉餵養兩種不同的環二肽底物，實現了該類天然產物的集約式生物合成🫵🏻，產生了至少93種以上新結構交叉二聚的吡咯並吲哚生物堿產物👩‍🦼🤠。這部分工作不僅在獲得的吡咯並吲哚生物堿數量上實現了大的飛躍（是此前已知的兩倍之多）🦿，還為改造其他吡咯並吲哚P450偶聯酶的底物選擇性提供了重要思路，為後期深入探究該類天然產物的生物活性奠定了堅實的基礎🧓🏼。

該研究工作受到了國家重點研發項目(2018YFC1706200，2020YFA0907700)🌅♤，國家自然科學基金面上項目（31770063）以及上海市超級博士後激勵計劃（2019193）的支持。

論文鏈接🧧⚆：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1002/anie.202304994